糖蛋白質組學研究的核心對象是糖基化蛋白質及其酶解產(chǎn)生的糖肽。在糖基化蛋白層面，完整的糖基化蛋白質需先經(jīng)分離富集，再進行后續(xù)分析鑒定。對于未知糖基化蛋白質，通常涉及多肽序列測定、糖基化位點定位以及聚糖組成與結構解析。糖肽分析則普遍采用的策略：先將糖基化蛋白質酶切，富集目標糖肽，最后進行質譜檢測。此方法已廣泛應用于基于糖蛋白質組學的生物標志物發(fā)掘。然而，蛋白質糖基化修飾極其復雜，表現(xiàn)為同一糖基化位點可能連接結構不同的糖鏈（糖鏈微觀不均一性），這為利用質譜技術分析復雜樣本中的糖肽帶來了顯著挑戰(zhàn)。加之在復雜生物樣本中，糖基化蛋白質通常豐度較低，且酶切后糖肽僅占所有酶解多肽的約2%~5%，因此在質譜分析前對糖基化蛋白質和糖肽進行有效的富集分離是不可少的步驟。

近年來，多種針對糖基化蛋白質/糖肽的富集技術被開發(fā)出來，包括離心、膜分離法、溶劑誘導沉淀、親水相互作用色譜法、凝集素親和色譜法、硼酸親和色譜法以及酰肼化學法等。其中，磁性固相萃?。∕agnetic Solid Phase Extraction, MSPE）技術利用磁性微納米材料作為吸附劑進行樣品前處理，已獲得廣泛應用。相較于固相萃取、液液萃取等傳統(tǒng)方法，MSPE具有操作簡便、有機溶劑消耗少、萃取效率高等優(yōu)勢。在該技術中，磁性微納米材料吸附劑是實現(xiàn)高效、選擇性富集的關鍵。通過對磁性微納米材料表面進行修飾或將其與其他材料復合，可顯著提升材料的物理和化學穩(wěn)定性。因此，功能化磁性微納米復合材料近年來在糖蛋白/糖肽富集領域展現(xiàn)出廣闊的應用前景。

我們推薦具有基于不同結合原理富集分離糖基化蛋白質和糖肽的MagBeads^®系列磁珠，包括氨基（殼聚糖）、葡聚糖（羧基化）、TiO₂、苯硼酸、刀豆蛋白A修飾的磁珠。該系列磁珠在富集結合糖基化蛋白質/糖肽后，無需經(jīng)過離心、過濾、色譜等復雜操作，只需要施加外加磁場便可進行目標蛋白分離，省去了繁多的樣品預處理和樣品分離過程。與傳統(tǒng)的分離純化方法相比，具有快速，高效，高純度等優(yōu)點。

親水性功能基團修飾的磁性微納米材料

糖基化蛋白質/肽段中的糖鏈成分含有大量的羥基，因此糖鏈具有極為顯著的親水性，而非糖基化蛋白質/肽段有著相對較強的疏水性?；谔腔鞍踪|/肽段與非糖基化蛋白質/肽段之間親水性和疏水性的差異，可利用親水性介質來富集相對較強的親水性糖基化蛋白質/肽段。MagBeads^®葡聚糖磁珠，氨基磁珠（殼聚糖）表面具有豐富的羧基和氨基，可通過親水相互作用用于糖基化蛋白質/肽段的分離富集。

凝集素修飾的磁性微納米材料

凝集素能夠識別某一特殊結構的單糖或聚糖中特定的序列，因此常被用作糖蛋白和糖肽富集的親和探針。由于各種類型糖鏈都有其對應的合適凝集素進行富集，因此凝集素親和法被廣泛應用于分離富集糖基化蛋白質。刀豆球蛋白A（Concanavalin A, ConA），是從刀豆（Canavalia ensiformis，洋刀豆）分離純化結晶的一種植物凝集素蛋白，無血型特異性。MagBeads^®刀豆蛋白A磁珠在Ca²⁺和Mn²⁺存在的情況下，對末端α-D-甘露糖基和α-D-葡糖基殘基具有親和力，能夠快速、高效、特異性地與糖蛋白、糖脂、多糖等帶有糖基化修飾的分子結合，可用于純化糖蛋白、捕獲細胞或細胞核。

基于金屬氧化物螯合作用的磁性微納米材料

TiO₂，ZrO₂等金屬氧化物適用于通過螯合作用富集含有豐富電子的糖基化蛋白（例如唾液酸化的糖基化蛋白）。根據(jù)Lewis酸堿理論，Ti(Ⅳ)為缺電子結構，能夠對含有豐富電子的唾液酸殘基產(chǎn)生特異性親和作用。通過這種螯合作用對糖基化蛋白的富集無任何破壞作用，能夠得到完整的糖鏈信息，為進一步的糖基化肽段的鑒定提供有力依據(jù)。目前TiO₂修飾的磁珠已被廣泛地應用于規(guī)模化磷酸化肽段的富集，而TiO₂修飾磁珠在糖基化蛋白質組學中應用甚少。MagBeads^®二氧化鈦磁珠可同時被應用于磷酸化肽及糖基化蛋白或糖肽的富集。

基于共價作用（硼酸化學）修飾的磁性微納米材料

硼酸是很有前途的特異性富集糖蛋白的親和配體。硼酸化學法富集糖蛋白和糖肽的原理如下：在堿性條件下，硼酸與糖鏈的順式二醇反應形成五元或六元環(huán)酯，并且在酸性條件下該反應可發(fā)生逆向移動，實現(xiàn)環(huán)酯斷裂，進而釋放富集的糖基化蛋白質或糖肽。和凝集素法親和法相比，硼酸親和法具有以下優(yōu)勢：首先硼酸親和對糖基化蛋白質具有廣泛的選擇性，不僅可以富集N-糖蛋白，也可以富集O-糖蛋白。其次，硼酸親和法可以通過簡單地改變環(huán)境pH值來控制糖蛋白的捕獲和釋放，最后，硼酸親合法可以通過揮發(fā)性酸性溶液洗脫被萃取的物質，與質譜全兼容。MagBeads^®苯硼酸固相萃取磁珠可通過硼酸親和法富集糖基化蛋白質或糖肽。

基于共價作用（酰肼化學）修飾的磁性微納米材料

與硼酸化學修飾似，酰肼化學法富集糖基化蛋白質和糖肽也是利用糖鏈上的多羥基結構。與之不同的是，酰肼化學法需首先通過高碘酸鹽將糖鏈上的順式二醇氧化為醛基，醛基進一步與固定相上的酰肼反應形成腙，從而被富集，最后通過酶切可將糖基化蛋白質/糖肽段釋放。

肼化學法富集糖蛋白及糖肽具有專一性強和無位點偏向性的優(yōu)點，但也存在著諸多問題，比如需要經(jīng)多步化學反應，增加了反應時間和樣品的復雜程度。肼對糖鏈的水解和脫乙酰作用會造成糖鏈結構的破壞，導致該方法適合糖基化位點的分析，而丟失糖鏈結構信息。

總結

綜上，糖基化蛋白質/糖肽作為蛋白質組學的重要組成部分，對其研究至關重要。合適的分離富集方法是對其進行深入研究的基礎。南京東納生物科技有限公司發(fā)展出系列基于磁固相萃取方法的磁珠，可將糖基化蛋白/糖肽的富集分離與各類檢測方法、生物信息學技術等有機結合，以推動蛋白質組學研究的突破。

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